Morphology and Nanomechanics of Sensory Neurons Growth Cones following Peripheral Nerve Injury

A prior peripheral nerve injury in vivo, promotes a rapid elongated mode of sensory neurons neurite regrowth in vitro. This in vitro model of conditioned axotomy allows analysis of the cellular and molecular mechanisms leading to an improved neurite re-growth. Our differential interference contrast microscopy and immunocytochemistry results show that conditioned axotomy, induced by sciatic nerve injury, did not increase somatic size of adult lumbar sensory neurons from mice dorsal root ganglia sensory neurons but promoted the appearance of larger neurites and growth cones. Using atomic force microscopy on live neurons, we investigated whether membrane mechanical properties of growth cones of axotomized neurons were modified following sciatic nerve injury. Our data revealed that neurons having a regenerative growth were characterized by softer growth cones, compared to control neurons. The increase of the growth cone membrane elasticity suggests a modification in the ratio and the inner framework of the main structural proteins

Cytotoxic CD8⁺ T lymphocytes expressing ALS-causing SOD1 mutant selectively trigger death of spinal motoneurons.

Adaptive immune response is part of the dynamic changes that accompany motoneuron loss in amyotrophic lateral sclerosis (ALS). CD4 <sup>+</sup> T cells that regulate a protective immunity during the neurodegenerative process have received the most attention. CD8 <sup>+</sup> T cells are also observed in the spinal cord of patients and ALS mice although their contribution to the disease still remains elusive. Here, we found that activated CD8 <sup>+</sup> T lymphocytes infiltrate the central nervous system (CNS) of a mouse model of ALS at the symptomatic stage. Selective ablation of CD8 <sup>+</sup> T cells in mice expressing the ALS-associated superoxide dismutase-1 (SOD1) <sup>G93A</sup> mutant decreased spinal motoneuron loss. Using motoneuron-CD8 <sup>+</sup> T cell coculture systems, we found that mutant SOD1-expressing CD8 <sup>+</sup> T lymphocytes selectively kill motoneurons. This cytotoxicity activity requires the recognition of the peptide-MHC-I complex (where MHC-I represents major histocompatibility complex class I). Measurement of interaction strength by atomic force microscopy-based single-cell force spectroscopy demonstrated a specific MHC-I-dependent interaction between motoneuron and SOD1 <sup> G93A </sup> CD8 <sup>+</sup> T cells. Activated mutant SOD1 CD8 <sup>+</sup> T cells produce interferon-γ, which elicits the expression of the MHC-I complex in motoneurons and exerts their cytotoxic function through Fas and granzyme pathways. In addition, analysis of the clonal diversity of CD8 <sup>+</sup> T cells in the periphery and CNS of ALS mice identified an antigen-restricted repertoire of their T cell receptor in the CNS. Our results suggest that self-directed immune response takes place during the course of the disease, contributing to the selective elimination of a subset of motoneurons in ALS

Bestrophine-1 (identification moléculaire)

La lésion nerveuse périphérique provoque dans les neurones sensoriels le passage d'un état de transmission à un état de régénération dans l'optique de recouvrer la sensibilité périphérique. Des modifications phénotypiques importantes supportent ce processus. Des études précédentes ont montré que les neurones de ganglions rachidiens dorsaux présentent des modifications importantes de l'homéostasie chlorure. En effet, ils expriment un courant chlorure activé par le calcium (CaCC) et leur concentration intracellulaire en ions chlorures est augmentée. Les travaux effectués au cours de ma thèse de doctorat montrent que le traumatisme périphérique induit la surexpression du gène Best1, dont la protéine Bestrophin-1, sous tend l'expression de CaCC dans les neurones sensoriels, par des méthodes d'enregistrements électrophysiologiques et d'expression génique. De plus, l'étude des mécanismes de régulation de CaCC permettent de mettre en lumière une implication de la matrice extracellulaire dans la sécrétion de la cytokine interleukin-6, qui en retour favorise la surexpression du gène Best1. Les ions chlorures participent également à l'activation de CaCC, sans pour autant que le mécanisme ne soit pour l'heure défini. Dans un troisième temps, l'inhibition par ARN interférence et l'invalidation génétique de la Bestrophin-1 conduit à une diminution de la vitesse de pousse in vitro des neurites ainsi qu'à un ralentissement du recouvrement de la sensibilité périphérique. Cette implication de la Bestrophin-1 dans les mécanismes de régénération peut être due à la sensibilité du canal à un étirement membranaireSensory neurons shift from a transmitting mode to a regenerative state following peripheral nerve injury. This modification is necessary to the peripheral sensitivity recovery. Massive phenotypic changes support this process. Previous study demonstrated that neurons from dorsal root ganglia show important changes in their chloride homeostasis. Indeed, they express calcium-activated chloride currents (CaCC) and they present a two fold increase in their intracellular chloride concentration. We demonstrate that peripheral nerve injury leads to the sur-expression of the Best1 gene, and its protein supports functional expression of CaCC by electrophysiological recordings and quantitative gene expression strategies. Moreover, studying regulation mechanisms highlight the involvement of the extracellular matrix in the secretion of the cytokine interleukin-6, which in turn promotes the expression of Best1. Chloride ions are part of the CaCC regulatory machinery, but the mechanism is still elusive. In the third part, we demonstrate that Bestrophin-1 inhibition by RNA interference and genetic invalidation decreases the neurite outgrowth velocity in vivo and slow down the peripheral sensibility recovery. The Bestrophin-1 involvement in regenerative process might be due to its membrane stretch sensibilityMONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

Rôle et régulation des co-transporteurs cation-chlorure NKCC1 et KCC3 dans les neurones sensitifs

L'homéostasie chlorure (HC) est un acteur essentiel dans la transmission nerveuse. Le GABA, via son récepteur GABAA, permet les mouvements d'ions chlorures en fonction de leur potentiel électrochimique. Dans les neurones sensitifs de ganglions rachidiens dorsaux (GRD), le co-transporteur cation-chlorure NKCC1 est responsable de l'accumulation intracellulaire des ions Cl- et de l'effet dépolarisant du GABA. Suite à une lésion, l'augmentation de la concentration intracellulaire en ions Cl- ([Cl-]i) permet une amélioration des capacités régénératives neuronales. Au cours de ma thèse, je me suis en premier lieu intéressé à la régulation de l'HC par interleukine 6 (IL6) en réponse à une lésion nerveuse. L'axotomie du nerf sciatique induit l'expression de l'IL6 et son récepteur IL6-Ra dans les neurones sensitifs des GRD lombaires L4-L5. Des mesures par patch perforé sur des neurones sensitifs en culture ont montré une augmentation de la [Cl-]i dépendante de l'IL6 dans une sous-population de neurones mécano- et proprioceptifs en réponse à l'axotomie. Cette régulation est permise par la phosphorylation à la membrane plasmique neuronale de NKCC1. Le co-transporteur KCC3 est impliqué dans une maladie génétique conduisant dès la naissance à une perte sensorimotrice, ce qui m'a conduit à étudier son rôle dans la régulation de l'HC des neurones sensitifs au cours du développement et chez l'adulte. Nos données ont démontré l'existence d'un switch chlorure développemental, diminuant la [Cl-]i. Ce switch est altéré chez la souris KCC3-/-, dans laquelle une partie des neurones a déjà diminué sa [Cl-]i. Au stade adulte, nous avons également observé un doublement de la [Cl-]i dans 30% des neurones sensitifs de souris KCC3-/-, pourcentage corrélé à la proportion de neurones WT exprimant KCC3. Ces données prouvent que KCC3 est impliqué, de manière directe ou non, dans la régulation de l'HC des neurones sensitifs au cours du développement et chez l'adulte.Chloride homeostasis (CH) is a major component of nerve transmission. Interaction between the neurotransmitter GABA and his receptor, GABAA, allows chloride movements depending on electrochemical potential. In dorsal root ganglia (DRG) sensory neurons, the cation-chloride cotransporter NKCC1 is responsible for intracellular accumulation of chloride ions and depolarizing effects of GABA. After injury, an increase of intracellulaire chloride concentration ([Cl-]i) allows an improvement of neuronal regenerative capacities. In a first time, I worked on regulation of CH by interleukine 6 (IL6) in response to nerve injury. Axotomy of the sciatic nerve induces expression of IL6 and his receptor IL6-Ra in sensory neurons from lombar L4-L5 DRG. Perforated patch measurements of sensory neurons have demonstrated an increase of [Cl-]i depending on IL6 in a sub-population of mechano- and proprioceptors in response to lesion. This regulation is provided by phosphorylation at the neuronal plasma membrane of NKCC1. The cation-chloride cotransporter KCC3 is implicated in a hereditary syndrome leading after birth to sensorymotors defects. This is why I have studied his role in regulation of CH in sensory neurons during development and in adulthood. Data have shown the existence of a peripheral developmental chloride switch . This switch is abolished in KCC3-/- sensory neurons, in which a part of neurons has already decreased [Cl-]i. In adulthood, we also observed an [Cl-]i twice as much as WT in 30% of sensory neurons from KCC3-/- mice. This percentage is correlated to the proportion of WT neurons expressing KCC3. These results demonstrate for the first time that KCC3 is implicated in regulation of CH in sensory neurons during development and in adulthood.MONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

Modification de l'expression de canaux ioniques dans les neurones de ganglions rachidiens dorsaux de souris adulte après lésion nerveuse périphérique

MONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

Homéostasie chlorure des neurones de ganglions rachidiens dorsaux et physiopathologie du système nerveux périphérique

La lésion nerveuse périphérique conduit à des remaniements cellulaires et moléculaires des neurones sensitifs nécessaires à une régénération fonctionnelle. La lésion peut conduire à des neuropathies post traumatiques responsables de douleurs chroniques et de comportements ataxiques. Au cours de ma thèse j'ai étudié le rôle de l'homéostasie chlorure (HC) des neurones de ganglions rachidiens dorsaux (GRD) dans les processus de régénération et d'induction de douleurs inflammatoires. Les mesures des concentrations intracellulaire en ions chlorure ([Cl-]i) ont été réalisées sur des cultures primaires de neurones. J'ai montré que la lésion du nerf sciatique (in vivo) induit la phosphorylation du co-transporteur membranaire Na+-K+-2Cl- (NKCC1) dans les neurones sensitifs de GRD. Cette phosphorylation entraîne son activation qui provoque l'augmentation de la [Cl-]i. L'inhibition pharmacologique par le bumétanide et l'invalidation génétique de NKCC1 conduit à une diminution de la vitesse de la repousse des neurites. NKCC1 apparaît donc comme un acteur clé dans les mécanismes de régénération nerveuse périphérique. L'étude des voies de signalisation intracellulaire impliquées dans la phosphorylation du co-transporteur suggère un rôle majeur de l'interleukine 6 dans l'activation de ces voies et donc dans les mécanismes de réparation nerveuse. En parallèle l'étude des douleurs inflammatoires révèle dans un modèle d'arthrite rhumatoïde murin, une augmentation de l'HC dans les neurones sensitifs. Ainsi, ces travaux montrent pour la première fois que la modulation de l'HC participe aux mécanismes de régénération nerveuse et probablement dans ceux de l'induction de douleurs inflammatoiresPeripheral nerve injury induces cellular and molecular changes in order to produce functional regeneration. This phenomenon can conduct to post traumatic neuropathies that are responsible for chronic pain and ataxic comportment. During my thesis I have analysed the role of chloride homeostasis in an in vitro model of sensory neuron regeneration and in inflammatory pain. My work showed that sciatic nerve injury in adult mice induced a two-fold increase in the intracellular chloride concentrations of axotomized sensory neurons. I demonstrated that phosphorylation of the Na-K-Cl co-transporter NKCC1 was responsible for this increase. In addition, NKCC1 inhibition led to a decrease in the growth velocity of neurites of axotomized neurons, emphasizing a fundamental role of NKCC1 in the regeneration process. I also elucidated the intracellular signalling pathway leading to NKCC1 phosphorylation and showed a fundamental role of interleukine 6 in the activation of those pathways. In parallel studying inflammatory pain in a mouse model revealed that the rheumatoid arthritis affects chloride homeostasis in peripheral sensory neurons. This change in chloride homeostasis could take part in the induction of pain. Therefore, this work shows for the first time that chloride homeostasis participated in the mechanism of nerve regeneration and likely inflammatory pain processMONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

[C-Kit tyrosine kinase receptor: a new analgesic target?]

International audienc

Influence de l'acupuncture électrique sur la régénération du nerf sciatique lésé chez la souris

Le but de cette étude était d'évaluer les effets de l'électro-acupuncture sur la récupération fonctionnelle des réponses sensori-motrices après écrasement du nerf sciatique gauche de la souris. L'évaluation sensitive était testée par la sensibilité mécanique et celle à la chaleur par les tests de Von Frey et de Hargreaves, respectivement. L'analyse de la démarche était faite pour évaluer la récupération sensori-motrice. Après l'écrasement du nerf, nous avons analysé la récupération fonctionnelle d'un groupe contrôle non traité avec un groupe ayant eu des séances d'électro-acupuncture. Celle ci était délivrée au niveau de la patte lésée sous anesthésie dans les acupoints (GB 30 et GB 34). Nos résultats montrent que dans le groupe contrôle la récupération sensitive s'effectue en 5-6 semaines. Une période de douleur de 2 semaines précède le retour à la normale. L'électro-acupuncture n'accélère pas le temps de récupération sensitive et empêche les comportements douloureux uniquement lorsque appliquée au moment des symptômes. L'analyse de la démarche en relation avec les tests sensitifs suggère que l'électro-acupuncture améliore spécifiquement la récupération motrice. Ces données suggèrent que l'électro-acupuncture exerce une influence positive sur la régénération des fibres motrices et est efficace dans le traitement des signes douloureux induits par le traumatisme nerveux. Nos données indiquent que la combinaison de tests sensitifs purs avec des tests mixtes sensori-moteurs permettent d'évaluer le temps de récupération complète et de déterminer des paramètres cinétiques différents dans la restauration des fonctions mixtes du nerf sciatiqueThe sciatic nerve crush model is a well characterized model for peripheral nerve regeneration. Such a lesion often followed by defaults in reinnervation with as major consequence arousing of neuropathic pain. The aim of this study was to assess the effects of electro-acupuncture on the functional recovery of sensori-motor responses after left sciatic nerve crush. Female mice, aged 7 weeks, were tested for mechanical and heat sensitivity for sensory evaluation. Gait analysis was performed for assessment of sensori-motor recovery. Following sciatic nerve crush, a control group was compared to electro-acupuncture-treated group. Electro-acupuncture was applied on the injured limb under isoflurane anesthesia in the acupoints (GB 30 and GB 34). Our results show that normal sensory recovery is achieved in five-six weeks. A two weeks period of pain preceded normal sensitivity recovery. Electro-acupuncture alleviated pain-related behaviors only when applied during this period. Application before development of painful symptoms did not prevent their appearance. Analysis of gait in relation with the sensory tests suggests that electro-acupuncture specifically improved motor recovery. Taken together, our results suggest that electro-acupuncture exerts a positive influence on the motor fibers regeneration and is efficient in the treatment of pain symptoms. In addition, our data indicate that a simultaneous utilization of pure sensory tests together with a mixed sensori-motor test offers a more reliable picture to assess not only the timing of full recovery but also to determinate some differential kinetic parameters in the restoration of the mixed functions of the sciatic nerveMONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF